Allgemeines zu Coronaviren

Systembiologische Ansätze zur Identifizierung von Interaktionen zwischen viralen und zellulären Proteinen von Coronaviren (AG von Brunn)

Coronaviren verursachen in verschiedenen Tierspezies (Huhn, Maus, Ratte, Truthahn, Schwein, Hund, Katze, Kaninchen, Pferd, Kuh, Fledermaus) einschließlich des Menschen respiratorische, gastrointestinale, sowie Krankheiten des zentralen Nervensystems. Bei einigen Nutztierarten sind enorme wirtschaftliche Schäden die Folge.Humanpathogenen Coronaviren HCoV-229E und HCoV-OC43 wurden 1966 und 1967 aus den Nasalhöhlen infizierter Patienten isoliert. Abhängig von jahreszeitlichen Schwankungen werden sie für etwa 30% der respiratorischen Infekte („Erkältungen“) des Menschen mit normalerweise mildem Verlauf als verantwortlich erkannt. Mit dem pandemischen Ausbruch von SARS („Severe Acute Respiratory Syndrome“) im Jahr 2003 erlangte die Virusfamilie weltweit besondere Aufmerksamkeit, nachdem ein Coronavirus, nämlich das SARS-CoV als ursächliches Agens nachgewiesen worden war. In schweren Fällen verlief die Infektion dramatisch mit diffusen alveoläre Schädigungen, atypischen Pneumonien mit konstantem Fieber und fortschreitender Dyspnoe und abrupter Verschlechterung der Lungenfunktion. Die Letalitätsrate betrug etwa 10%. Retrospektiv stellte sich heraus, daß das SARS-CoV zoonotischen Ursprungs ist und aus Wildtierreservoiren, nämlich Fledermäusen stammt. Über infizierte Zibetkatzen ging es auf den Menschen über.Auf der Suche nach neuen Coronaviren wurden in den Jahren 2004 und 2005 zwei neue Familienmitglieder HCoV-NL63 und HCoV-HKU1 identifiziert. Diese verursachen ernste Infektionen des unteren Respirationstraktes (1-5% in Kindern und Erwachsenen) einschließlich Krupp in Kleinkindern (NL63).Coronaviren verursachen leichte bis sehr schwere Erkrankungen mit tödlichen Folgen in Tier und Mensch. Nicht zu unterschätzen sind die normalerweise selbst ausheilenden Erkältungskrankheiten im Menschen, da neben den eigentlichen unangenehmen Erkrankungserscheinungen enorme wirtschaftliche Schäden (e.g. Arbeitsausfall) die Folge sind. Ziel der Arbeitsgruppe ist es, durch systematische Studien der intraviralen und Virus – Wirt Protein – Protein Wechselwirkungen Angriffspunkte zur antiviralen Interaktion zu definieren.

Projekt 1: SARS-CoV Systembiologie Ansatz I: vom Genom zum Orfeom und intraviralen Protein Interaktom

(Albrecht von Brunn, Thorsten Stellberger, Javier Carbajo,
ehemalig: Julia Schöpf, Carola Teepe)

Wichtige Schritte der SARS Pathogenese sind mangels effizienter in vitro- und in vivo Experimentalsysteme ungeklärt. Von den drei „Klassen“ an Coronavirus-Proteinen (Nichtstrukturproteine (nsp), Strukturproteine, akzessorische Proteine) wurden bisher die für den Replikationsprozess verantwortlichen nsp´s am intensivsten untersucht. Um mehr über die Wirkungsweisen und Wechselbeziehungen all dieser Proteine zu lernen, haben wir das SARS-CoV Orfeom PCR- amplifiziert und mittels hochdurchsatzkompatibler, rekombinatorischer Klonierung (Invitrogen GATEWAY™) vervielfältigt. Diese Methode basiert auf der Rekombinase des Bakteriophagen Lambda, über welche die Gene zuächst in einen sogenannten „Entry“ Vektor und anschließend in „Destination“ Vektoren für verschiedene Expressionsysteme überführt werden. Aus diesem Ansatz ergeben sich drei zentrale Themenbereiche (Abb. 1):
1.   „Localizome“: Die Expression der SARS-CoV ORF´s in pCR3-basierenden HIS-Flag Fusionsanker Plasmiden ermöglicht mit Hilfe von Antikörpern gegen die Anker und Immunfluoreszenz die Erstellung eines „Localizomes“, d.h. der Lokalisierung der ORF´s in der eukaryotischen Zelle (Zus.arbeit R. Pepperkok/J. Simpson, EMBL, HD).
2.   Entwicklung von molekularen Werkzeugen: Die Expression der SARS-CoV ORF´s in prokaryotischen Vektoren wird zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und monoklonalen Antikörpern für diagnostische und Forschungszwecke genutzt (Zus.arbeit F. Ebel, MvPI).
3.   Virus – Wirt Interaktionsanalyse: In einem Matrix-basierenden Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Ansatz werden intravirale Protein-Protein Interaktionen identifiziert und mit einem zweiten Bestätigungstest (Koimmunpräzipitation, CoIP) überprüft. Von etwa 900 getesteten paarweisen Interaktionen identifizierten wir bisher mehr als 65 (7%) als positiv. Hiervon wurden 38% in der CoIP bestätigt. Die uns am interessantesten erscheinenden Interaktionen werden zur Entwicklung von antiviralen Strategien weiter untersucht.

: Abb. 1: SARS-CoV Systembiologie Ansatz I: vom Genom zum „Lokalizome“, zur Entwicklung von molekularen Werkzeugen und zum intraviralen Protein Interaktom

Projekt 2: SARS-CoV Systembiologie Ansatz II: vom Orfeom zum Virus - Wirt Protein Interaktom

(Albrecht von Brunn, Thorsten Stellberger, Javier Carbajo,
ehemalig: Julia Schöpf)

Dieses Projekt wird im Rahmen eines BMBF- geförderten Verbundpro-jektes „SARS: Ökologie und Pathogenese einer archetypischen Zoonose“ bearbeitet.

: Abb. 2: SARS-CoV Systembiologie Ansatz II: vom Orfeome zum Virus - Wirt Protein Interaktom

Das Hauptziel dieses systembiologischen Ansatzes (Abb. 2) ist die genomweite Analyse der Interaktionen des kompletten Sets des SARS-CoV Orfeoms mit humanen cDNA Banken. Mit Hilfe von Hochdurchsatztechnologien werden mögliche virale und zelluläre Interaktionspartner zunächst mittels Y2H System, PCR Amplifikation, Sequenzierung und Blast Analysen identifiziert (Zus.arbeit M. Kögl, DKFZ, HD). Für weitere Untersuchungen der gefundenen zellulären Gene steht eine Kollektion von etwa 12 000 humanen cDNA Klonen zur Verfügung. Die gefundenen Interaktionen werden in einem weiteren Interaktionstest (Lumier Test) in eukaryotischen HEK 293 Zellen überprüft. Das System basiert auf der kreuzweisen Fusion der entsprechenden viralen und zellulären Gene an die Gene des Protein A und der Luziferase. Das Protein A Fusionsprotein dient der Aufreinigung der Interaktionskomplexe über IgG- gekoppelte Magnet Kügelchen. Das Luziferase Fusionsprotein ermöglicht die Messung von Luziferase Aktivität im Falle einer Interaktion der viralen und zellulären Proteine.
Mit Hilfe der Bioinformatik (R. Zimmer und C. Friedel, LMU) werden Virus- Wirt Interaktionsnetzwerke erstellt, um die Bedeutung der Interaktionspartner für zelluläre Prozesse, welche für die Replikation von SARS-CoV in vitro und in vivo wichtig sind, heraus zu finden (Abb. 3).

: Abb. 3: SARS-CoV – host protein interaction network

In Zusammenarbeit mit unseren Kooperationspartnern aus dem SARS Zoonose Verbund des BMBF (AGs C. Drosten, F. Weber, S. Pöhlmann, G. Herrler, H.-J. Thiel, V. Thiel) wird die Relevanz einiger gefundener Interaktionen mit Hilfe verschiedener Virusmutanten untersucht, um auf Molekülebene Angriffspunkte für antiretrovirale Strategien und pathogenetische Zusammenhänge zu definieren.
Einige Projekte werden in Zusammenarbeit mit der AG J. Haas (Max-von-Pettenkofer Institut, Lehrstuhl Virologie, LMU München), welche sich mit der genomweiten Protein-Protein Interaktionsanalyse verschiedener Pathogene beschäftigt, durchgeführt.