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Forschung

1. Projekte zur angeborenen Immunität im Yersinia-Mausinfektionsmodell
(Stefan Wölke, Bettina Sedlmaier-Erlenfeld, Gisela Anding, Jürgen Heesemann)

Yersinien vermehren sich extrazellulär und setzen wahrscheinlich Membrankomponenten (LPS, PG, Lipoprotein) frei, die als „pathogen-associated molecular patterns“ (PAMPs) über PAMP-Rezeptoren der Wirtszellen (Toll-like-Rezeptoren, TLR) und zytosolische Sensoren (z. B. Nod1/2) eine entzündliche Abwehrreaktion auslösen. Wir untersuchen die Yersinia-Empfänglichkeit  in Abhängigkeit von TLRs und Nods unter Verwendung von entsprechenden TLR- bzw. Nod-ko Mäusen. Neben Keimzahlbestimmungen der infizierten Organe wird das induzierte Chemokin/Zytokinmuster bestimmt und die histopathologischen Veränderungen im lymphatischen Gewebe werden mittels Immunohistologie (Kryoschnitte der Organe) untersucht.
Das Yersinia-Protein LcrV induziert über TLR-2 in myeloischen Zellen IL-10, das über seine immunosuppresive Wirkung die Yersinia-Infektion begünstigt. Um die IL-10 Produktion auf Einzelzellebene zu untersuchen, wurde von H. Bouabe eine IL-10 Reportermaus mit Betalaktamase als Reporterenzym hergestellt. Die Betalaktamase-Aktivität einzelner Zellen kann ratiometrisch bestimmt werden mit dem FRET-Substrat CCF2 (Coumarin-Cephaloaporin-Fluoreszein) und FACS-Analyse.

Ansprechpartner: Jürgen Heesemann Tel. 2180-72800, Stefan Wölke Tel. 2180-72880

Publikationen:
Heesemann J, Sing A, Trülzsch K.
Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense.
Curr Opin Microbiol. 2006 Feb;9(1):55-61. Epub 2006 Jan 18.

Bouabe H, Liu Y, Moser M, Bösl MR, Heesemann J. 2011
Novel highly sensitive IL-10-beta-lactamase reporter mouse reveals cells of the innate immune system as a substantial source of IL-10 in vivo.
J Immunol. 187:3165-76.

Bouabe H, Moser M, Heesemann J. 2011
Transgenic Res. 187:3165-76.
Enhanced selection for homologous-recombinant embryonic stem cell clones by Cre recombinase-mediated deletion of the positive selection marker.

Lech M, Kantner C, Kulkarni OP, Ryu M, Vlasova E, Heesemann J, Anz D, Endres S, Kobayashi KS, Flavell RA, Martin J, Anders HJ. 2011
Interleukin-1 receptor-associated kinase-M suppresses systemic lupus erythematosus.
Ann Rheum Dis. 70:2207-17.

Dissertation Dr. rer. nat. Ekaterina Lenk
“Die Rolle der angeborenen Immunität für die Yersinia-Infektion im Mausmodell”

Dissertation Dr. rer. nat. Beate Czech
"Untersuchungen zur Interaktion und Modulation von Yersinia enterocolitica mit neutrophilen Granulozyten in Suspension und im dreidimensionalen Kollagengel"

2. Zelluläre Mikrobiologie: Yersinia Toolbox und Rho GTPasen
(Stefan Wölke, Anette Schulz, Maximilian Frömberg, Saskia Wassermann)

Die kleinen Rho GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 sind wichtige „Schalter“ in Wirtszellen, die Signale von der Zytoplasmamembran zu Effektoren im Zytoplasma oder Zellkern weiterleiten. Die resultierenden Wirkungen zeigen sich als Zytoskelettumlagerungen (z.B. Stressfaserbildung, Phagozytose, Zellmigration) oder Translations-/Transkriptionsereignisse (Chemokin-/Zytokin-Antwort). Rho GTPasen werden durch „GTPase exchange factors“ (GEF) aktiviert (Rho-GDP  =>  Rho-GTP) oder durch GTPase-aktivierende Proteine (GAP) inaktiviert. Pathogene Bakterien wie Yersinien, Shigellen oder Salmonellen können die Wirtszell-Rho GTPasen durch „Injektion“ von GEF- oder GAP-Mimetika modulieren. Die Injektion dieser Mimetika in die Wirtszelle erfolgt über ein Typ 3 Proteinsekretionssystem (T3SS). Vom pYV-Plasmid der Yersinien konnten wir die Determinanten für das Ysc-T3SS separat klonieren (pT3SS) und mit weiteren Plasmiden, die Gene für T3SS-Effektoren tragen, kombinieren und so ein Yersinia Toolbox-System etablieren. Wir haben mit dem Yersinia Toolbox-System bereits von Shigellen die Effektoren IpgB1 (Rac1-GEF) und IpgB2 (RhoA-GEF), von Escherichia coli den Effektor Map (Cdc42-GEF), von Yersinia enterocolitica die Effektoren YopE (RhoG/Rac1-GAP) und YopT (Protease, spaltet geranylgeranyliertes C-terminales Cystein von Rho GTPasen ab) im Zellkultursystem hinsichtlich der Phagozytosemodulation erfolgreich anwenden können (siehe Abbildung).
In Zukunft soll die Yersinia-Toolbox auch zur Analyse von komplexen Signalkaskaden verwendet werden. Hierfür stehen uns auch Mausmakrophagen mit definierten Rho GTPase-Defizienzen (konditionale ko-Mäuse) zur Verfügung.

Ansprechpartner: Stefan Wölke, Tel. 2180-72880

Publikationen
Wölke S, Ackermann N, Heesemann J. 2011
The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins.
Cell Microbiol. 13:1339-57.

Stefan Wölke, Jürgen Heesemann. 2012
Probing the cellular effects of bacterial effector proteins with the Yersinia toolbox, Future Microbiology, 7 (4), 449-456

Rothmeier E, Pfaffinger G, Hoffmann C, Harrison CF, Grabmayr H, Repnik U, Wölke S, Bausch A, Griffith G,Taubenberger AM, Itzen A and Hilbi H. 2013
Activation of Ran GTPase by a Legionella effector promotes microtubule polymerization, pathogen vacuole motility and infection.
PLOS Pathogens, September 2013 e1003598

Schematische Darstellung des Yersinia Toolbox-Konzepts: Mit Hilfe der Yersinia Toolbox können singuläre T3SS-Effektoren von Yersinia enterocolitica und auch anderen Erregern in die Wirtszelle injiziert werde und somit deren Wirkung auf zelluläre Signalkaskaden wie z.B. die der Rho GTPasen untersucht werden.

3. Dreidimensionales Kollagengel (3D-CoG)-Infektionsmodell und Real-Time Bioimaging
(Kristina Gramlich, Tobias Veit, Stefanie Böllner, Jürgen Heesemann)

Infektionsprozesse können in vitro mit Zellkultursystemen (cell monolayer) oder in vivo im Tiermodell untersucht werden. Die Zellkulturmodelle sind weniger komplex als Tiermodelle, allerdings führen sie häufig zu Artefakten, da es sich meistens um immortalisierte Zellen mit fehlendem dreidimensionalen Gewebekontext handelt. Dagegen sind Tiermodelle sehr komplex und die Dynamik von Pathomechanismen lässt sich nur an der Gewebeoberfläche studieren. Das 3D-CoG hat sich als guter Kompromiss erwiesen, um Zellmigration und mikrobielles Wachstum unter gewebeähnlichen Bedingungen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Da pathogene Bakterien häufig an ihrer Oberfläche Bindeproteine für extrazelluläre Matrix (ECM)-Komponenten (Kollagen, Fibronektin, Fibrinogen u.a.) tragen, kann im 3D-CoG auch die Interaktion von ECM-Komponenten mit Bakterien untersucht werden (Abb. 3).
Wir untersuchen das Wachstum von Yersinien und Staphylokokken im 3D-CoG und im 3D-CoG mit ECM-Zusätzen. Für Staphylococcus aureus konnten wir mit dieser Methode den zwei Koagulasen Coa und vWbp räumlich separierte Staphylothrombinaktivität bzw. Fibrinkapselbildung zuordnen. Auch konnte das Migrationsverhalten von Neutrophilen im Staphylokokken-3D-CoG analysiert werden. Yersinia enterocolitica zeigt im 3D-CoG ein ähnliches YadA-abhängiges Mikrokoloniewachstum wie im infizierten Gewebe. Das 3D-CoG hat sich auch für das Studium der Interaktion von Yersinien mit Neutrophilen als geeignet erwiesen (Migration, Phagozytose, ROS-Bildung u.a.).

Ansprechpartner: Jürgen Heesemann, Tel. 2180-72800

Publikationen:
Guggenberger C, Wolz C, Morrissey JA, Heesemann J. 2012
Two Distinct Coagulase-Dependent Barriers Protect Staphylococcus aureus from Neutrophils in a Three Dimensional in vitro Infection Model.
PLoS Pathog. 8:e1002434.

Trček J, Oellerich MF, Niedung K, Ebel F, Freund S, Trülzsch K. 2011.
Gut proteases target Yersinia invasin in vivo.
BMC Res Notes; 4:129.

Trcek J, Fuchs TM, Trülzsch K. 2010
Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system.
Microbiology. 156(Pt 9):2734-45 .

Dissertation Dr. rer. nat. Christoph Guggenberger
“Analysis of host-pathogen interactions in novel three dimensional surrogate infection models”

Schematische Darstellung des Sandwich-Versuchsaufbaus: Mikroskop, 3D-CoG mit Bakterien, nativer Milz-Dünnschnitt mit GFP-Neutrophilen

4. Charakterisierung der β-Laktamasen von Yersinia enterocolitica und ihre Bedeutung für die Antibiotikaresistenz
(Eva-Maria Schriefer, Ilja Peyneshki, Enno Storz)

Yersinia enterocolitica besitzt zwei chromosomale Gene für β-Laktamasen: blaA und blaB/ampC. Die Transkription von blaB ist durch Imipenem induzierbar (typisch für Mitglieder der ampC-Familie), wogegen blaA konstitutiv exprimiert wird. Wir konnten durch Herstellung von Einzel- und Doppelmutanten (Delta blaB, Delta blaA, Delta blaA/Delta blaB) in Yersinia zeigen, dass BlaA die dominierende β-Laktamase ist. Weiterhin haben wir uns mit den Sekretionseigenschaften der Yersinia β-Laktamasen beschäftigt. Wir konnten zeigen, dass die β-Laktamasen mittels unterschiedlicher Systeme ins Periplasma transloziert werden: BlaB wird Sec-abhängig und BlaA Tat-abhängig transloziert. Die Sec-abhängige Translokation von β-Laktamasen ins Periplasma ist weit verbreitet, wohingegen die Tat-abhängige Translokation die Ausnahme bildet. Bisher bekannt sind Tat-abhängige β-Laktamasen nur in Stenotrophomonas, Mycobacterien, Xanthomonas und Burkholderia. Im Yersinien-Modell konnten wir außerdem zeigen, dass die β-Laktamase BlaA von Photorhabdus asymbiotica ebenfalls Tat-abhängig transloziert wird (BlaA von P. asymbiotica weist eine 69%ige Homologie auf Aminosäureebene zu BlaA von Y. enterocolitica auf). P. asymbiotica ist insekten- und humanpathogen und ist phylogenetisch nah verwandt mit Yersinien.

Interessanterweise tragen Y. pseudotuberculosis und Y. pestis keine β-Laktamase-Gene und sind erwartungsgemäß unter in vitro-Bedingungen empfindlich auf β-Laktam-Antibiotika. Im Mausinfektionsmodell erweisen sich Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis/Y. pestis als wenig empfindlich gegenüber der β-Laktam-Antibiotikabehandlung (in vivo-Bedingungen). Daher versuchen wir in unserer Arbeitsgruppe, das Rätsel der in vivo β-Laktam-Antibiotikaresistenz bei fehlenden β-Laktamase-Genen (Y. pseudotuberculosis/ Y. pestis bzw. β-Laktamase Doppelmutante Delta blaA/Delta blaB in Y. enterocolitica) zu lösen.

Ansprechpartner: Eva-Maria Schriefer, Tel. 2180-72859

Publikationen:

Schriefer EM, Hoffmann-Thoms S, Schmid FX. Schmid A, Heesemann J. 2013
Yersinia enterocolitica and Photorhabdus asymbiotica β-lactamases BlaA are exported by the twin-arginine translocation pathway
Int J Med Microbiol. 2013 Jan;303(1):16-24.

Dissertation Dr. rer. nat. Eva Maria Schriefer
„Molekulare und biochemische Charakterisierung der beta-Laktamasen von Yersinia enterocolitica und deren Sekretionsverhalten“

5. Regulatory mechanisms controlling pathogenicity of Yersinia enterocolitica
(Ombeline Rossier, Kristin Adler, Sara Kakoschke, Rima El Kurdi, Carla Madueno-Florian, Catharina Zeuzem)

   The bacterial genus Yersinia includes three human pathogenic species: Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, which cause intestinal infections, and Y. pestis, the agent of bubonic and pneumonic plague.  Y. enterocolitica represents the third cause of human bacterial gastrointestinal infections in Europe after Campylobacter ssp. and Salmonella ssp. and is especially prevalent among children under five years old.  Although the main reservoir for Y. enterocolitica is pigs, the ecology of this Gram-negative organism is largely unknown.  Upon ingestion of contaminated food or water, Y. enterocolitica is able to cross the intestinal epithelial lining and replicates mainly extracellularly in the mesenteric lymph nodes.
   What sets Y. enterocolitica apart is its remarkable adaptation to a whole range of environmental conditions, particularly temperature.  Not only can it survive at low temperature, but it can even grow at 4°C.  Interestingly, many pathogenicity factors associated with the bacterial surface are expressed in response to changes in temperature (Fig. 1).

Fig. 1 Envelope-associated pathogenicity factors produced by Y. enterocolitica
Fig. 2 Role of the RNA chaperone Hfq and sRNAs in post-transcriptional regulation. (A) Negative regulation by Hfq and sRNA. Hfq promotes the binding of sRNAs to their target mRNA thereby masking the ribosome binding site (orange square). Moreover Hfq can recruit the RNA degradosome machinery leading to sRNA and mRNA degradation. (B) Positive regulation by Hfq and sRNA. Hfq-mediated pairing of sRNA and mRNA unfolds the mRNA secondary structure, thereby allowing ribosome binding.

Research interests
   Our research focuses on regulatory mechanisms controlling the production of virulence factors in Y. enterocolitica.  Upon ingestion of contaminated food or water, Y. enterocolitica starts a perilous journey along the gastrointestinal tract.  The bacteria are faced with dramatic changes in temperature (sudden increase to 37°C), pH (acidic conditions in the stomach), exposure to bile salts (the body’s natural detergents) and other antimicrobial molecules, competition for nutrients with gut commensals and contact with cells from the host immune system.  Yet the bacteria are able to rapidly and successfully react to the many challenges by remodeling their surface and deploying an arsenal of pathogenicity factors necessary to colonize the host.  Key within the adaptation process is the bacterial response to envelope stress.
   Several regulatory processes contribute to the rapid adaptation of bacteria to changing environmental conditions.  One mechanism that has attracted a lot of attention in the past decade is post-transcriptional regulation mediated by small non-coding RNA (sRNA). sRNAs are usually 50-300 nucleotides long and act by complementary base pairing with their target mRNAs.  sRNA-mRNA binding affects mRNA structure, stability and/or translation, thereby modulating protein production (Fig.2).  Many sRNAs require the RNA chaperone Hfq for their stability and for binding with target mRNA (Fig. 2).
Hfq is conserved among enterobacteria, including Y. enterocolitica.  Our lab has recently demonstrated that Hfq is essential for the virulence of Y. enterocolitica in mice.  Accordingly, Hfq controls the production of several virulence factors.

Our current projects focus on:
1. Understanding molecular mechanisms underlying adaptation to envelope stress during infection

2. Identifying and characterizing sRNAs involved in regulating surface pathogenicity factors

Ansprechpartner: Ombeline Rossier Tel. 2180-72937/-72850

 

Publikationen

 T. Kakoschke, S. Kakoschke, G. Magistro, S. Schubert, M. Borath, J. Heesemann and O. Rossier.  2014.  The RNA chaperone Hfq impacts growth, metabolism and production of virulence factors in Yersinia enterocolitica. PLoS ONE 9(1): e86113. doi:10.1371/journal.pone.0086113