Diagnostik


Nationales Referenzzentrum für Retroviren

Das Nationale Referenzzentrums (NRZ) für Retroviren wurde zum 1. Oktober 2016 neu berufen. Unser Leistungsangebot im Bereich der Retrovirologie umfasst u.a. eine umfangreiche retrovirologische Spezial-Diagnostik, ärztliche Beratung/Unterstützung bei der Abklärung unklarer retrovirologischer Fälle oder einer eventuellen HIV-Transmission, sowie Öffentlichkeitsarbeit und nationale Qualitätssicherung im Bereich der Diagnostik (»Details).

Die Aktivitäten des NRZ für Retroviren werden durch grundlagen-orientierte, translationale und klinische Forschungsprojekte zu HIV in unserem Münchner Institut unterstützt.

Als offizielles Publikationsorgan des NRZ für Retroviren veröffentlichen wir ein „Retroviren Bulletin“. Hierin werden aktuelle wissenschaftliche und klinische Themen aus dem gesamten Spektrum der Retrovirologie für ein breites (Fach-) Publikum dargestellt.

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HIV-Diagnostik

Basisinformationen zu diagnostischen Methoden bei der HIV-Infektion

Das Krankheitsbild AIDS (Acquired Immuodeficiency Syndrome) wurde erstmalig 1981 beschrieben. Als Krankheitsauslöser konnten das Humane Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1, 1983) und das Humane Immundefizienz Virus Typ 2 (HIV-2, 1986) aus AIDS-Patienten isoliert werden. Die HIV-Infektion stellt ursprünglich eine Zoonose (Spezieswechsel Affe – Mensch) dar; anhand genetischer Analysen wird für die Übertragung der Beginn des 20. Jahrhunderts angenommen.

Weltweit sind ca. 38 Millionen Menschen (Stand 2021) mit HIV infiziert oder bereits an AIDS erkrankt, wobei über 90% aller HIV-Infizierten in Entwicklungsländern oder Schwellenländern leben. In Deutschland sind nach Schätzungen des Robert Koch-Instituts etwa 91.400 (Stand 2021) mit HIV infiziert.

Die HI-Viren werden über Blut und andere virushaltige Körperflüssigkeiten übertragen (Sperma, Vaginalsekret). Ungeschützte Sexualkontakte stellen bei weitem den häufigsten Übertragungsweg dar. Weiterhin kann HIV von der Mutter auf das Kind übertragen werden (Geburt, Stillen), durch gemeinsame Nutzung von Injektionsnadeln („needle-sharing“, insbesondere Drogenabhängige), durch ungetestete Bluttransfusionen oder Stich-/Schnitt-Verletzungen, z.B. bei medizinischem Personal. Das Ansteckungsrisiko steigt mit der Höhe der HI-Viruslast. Auch Läsionen der Genitalschleimhaut und zusätzlich vorliegende andere sexuell übertragbare Infektionen erhöhen das Übertragungsrisiko.

HIV-1 und HIV-2 gehören zur Familie Retroviridae und werden in verschiedene Gruppen und Subtypen unterteilt. Entscheidende Antigene für die serologische Virusdiagnostik sind das HIV-1 Kapsid-Protein (p24) und die Hüllproteine (gp120, gp41). Das Virusgenom besteht aus zwei RNA-Molekülen, das nach Umschreibung in die provirale DNA in das wirtszelleigene Genom integriert wird.

Diagnostik

Zum Nachweis oder Ausschluss einer HIV-Infektion werden, je nach Fragestellung und HIV-Seroprävalenz der Bevölkerung, unterschiedliche Testverfahren eingesetzt, die auf einem Antigen-/Antikörper-Nachweis oder Genom-Nachweis basieren.

Serologische Verfahren

Die wichtigste Methode der Screening-Diagnostik ist der HIV-1/2 Antigen/Antikörpernachweis (4. Generationstest, 4. Generation EIA). Die 4. Generationstestsysteme erfassen HIV-1- und HIV-2-spezifische Antikörper sowie  das virusspezifische HIV-1 p24-Antigen, das einen früheren labordiagnostischen Infektionsnachweis ermöglicht. Eine Differenzierung von Antikörpern und Antigen ist mittels Westernblot/Immunblot und Antigen-ELISA möglich.

Die spezifische Antikörperbildung nach einer HIV-Infektion (bzw. deren Nachweisbarkeit) beginnt in der Regel ab der 4. bis 10. Woche; die Antikörper persistieren als Infektionsmarker lebenslang. Nach der 6. Woche sind HIV-spezifische Antikörper bei vielen der neu infizierten Patienten nachweisbar. Bei negativem Screeningtest 6 Wochen nach einem möglichen Infektionsereignis, kann eine Infektion mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden.

Als „Schnelltest“ (Dauer ca. 30 Minuten) können immunchromatographische „Streifenteste“ zum qualitativen Nachweis von HIV-Antigen/Antikörpern in Serum oder Plasma durchgeführt werden.

Ein reaktiver („positiver“) HIV-Screeningtest erfordert in Deutschland immer die Folgetestung einer zweiten Patientenprobe (um eine Probenverwechslung auszuschließen) und muss zusätzlich durch ein zweites Testverfahren bestätigt werden. Hierfür stellen der klassische Westernblot oder der rekombinant hergestellte Immunoblot neben dem Nukleinsäurenachweis Methoden der Wahl dar.  Je nach Testhersteller ist eine Unterscheidung zwischen HIV-1 und HIV-2 möglich. Prinzip des Immunoblots-Verfahrens ist der Nachweis spezifischer Antikörper im Serum des Patienten, die mit den ihrem Molekulargewicht entsprechend auf einem Nitrozellulosestreifen aufgetrennten HIV-Proteinen reagieren. Bei HIV-Seropositivität binden die entsprechenden Antikörper im Serum des Patienten an die HIV-Proteine und können nachfolgend als „Banden“ auf dem Streifen sichtbar gemacht werden. Die Interpretation des Ergebnisses beim Nachweis nur einzelner reaktiver Banden kann schwierig sein. Die Bewertung bedarf großer Erfahrung, da unspezifische Testreaktionen, Kreuzreaktionen (z. B. auch zwischen HIV-1 ind HIV-2), unterschiedliche Stadien der HIV-Erkrankung, sowie maternale Antikörper beim Neugeborenen bei der Auswertung und Labordiagnose zu beachten sind. Unklare Testergebnisse erfordern in der Regel „Verlaufskontrollen“, d.h. die Einsendung weiterer Patientenproben.

HIV-Resistenztestung

HIV-Resistenztestung

Eine genotypische Resistenztestung im Kontext aller derzeit klinisch verwendeten HIV-Inhibitoren der Protease, Reversen Transkriptase, Integrase, gp41 (Fusionspeptid) und in der CCR5-Korezeptorbindungstelle in Env kann routinemäßig in unserem Institut durchgeführt werden. Die virale Sequenz wird mittels etablierter sequenzbasierter Algorithmen (Output der Stanford Database, ANRS, G2P in HIV-GRADE implementiert) einer Interpretation der detektierten Mutationen unterzogen. Der Untersuchungsbefund umfasst eine Auflistung der Resistenzmutationen und eine Einstufung der nachgewiesenen Viren hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber gebräuchlichen antiretroviralen Medikamenten. Dies sind essentielle Informationen bei Therapieversagen und bilden die Grundlage für einen möglichen Therapiewechsel.

Sollte die in Frage stehende Sequenz hierüber nicht eindeutig zu interpretieren sein, wird in einem zweiten Schritt die Durchführung einer phänotypischen Resistenztestung durchgeführt. Eine solche phänotypische Resistenztestung – obwohl aufwändig, langsam und kostenintensiv – kann im Kontext neuer Mutationsmuster oder seltenerer HIV-1 Subtypen notwendig sein. Hierfür wird eine direkte Messung der Medikamenten Empfindlichkeit eines rekombinanten, replikationskompetenten Virus in Zellkultur durchgeführt. Dieses Virus enthält die aus Patienten Virus-abgeleitete Sequenz der Reversen Transkriptase oder Protease und ermöglicht so eine aussagekräftige Aktivitätstestung antiviraler Substanzen. Hierfür informieren wir Sie über die Notwendigkeit einer neuen Blutentnahme bei Ihrem Patienten.
Einzelheiten über das notwendige Probenvolumen (insbesondere bei Viruslasten < 1.000 RNA Kopien/mL), den Probenversand an das NRZ und die entstehenden Kosten finden Sie unter Downloads.

HIV-Stammsammlung

HIV-Stammsammlung

Die Stammsammlung des Nationalen Referenzzentrums für Retroviren beinhaltet aktuell:

9 Stämme aus der HIV-1 Gruppe M
2 Stämme aus der HIV-1 Gruppe O
6 HIV-2 Stämme

Details entnehmen Sie bitte dem „Infoblatt zur Stammsammlung des Nationalen Referenzzentrums für Retroviren“. Jedes Aliquot ist Hitze-inaktiviert (60°C, 60 Min.) und enthält ca. 1 ml Proben-Volumen.
Der Bestellschein für die Stammsammlung des Nationalen Referenzzentrums für Retroviren liegt als pdf-Datei vor. Bitte drucken Sie sich den Schein aus und schicken ihn vollständig ausgefüllt per Fax, per Post oder eingescannt per E-Mail an die auf dem Schein angegebene Anschrift zurück.

Die jeweiligen Gruppen sind einzeln bestellbar. Die Aufwandsentschädigung beträgt:

270 Euro für die Gruppe M
60 Euro für die Gruppe O
180 Euro für HIV-2
 zzgl. 19% MWSt sowie ggf. Transportkosten von ca. 20 Euro

Eine Bestellung von einzelnen Stämmen innerhalb einer Gruppe ist nur auf Anfrage möglich (per Telefon: +49-89 2180-72834), gleiches gilt für den Versand von Proben ins Ausland.

Der Versand an die von Ihnen genannte Lieferadresse erfolgt auf Trockeneis und wird von uns organisiert. Sie erhalten vorab eine E-Mail mit dem voraussichtlichen Liefertermin. Eine separate Rechnung (inkl. der anfallenden Transportkosten) erhalten Sie nach dem Versand.

HIV NRZ Stammsammlung

NRZ Bestellschein

HTLV-Diagnostik

Basisinformationen zur Diagnostik Humaner T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV)

Im Rahmen der Diagnostik von Infektionen durch HTLV-1/2 kommen sowohl direkte (Nukleinsäurenachweise) als auch indirekte Nachweisverfahren (Antikörpernachweise) zum Einsatz.

Serologische Verfahren

Die wichtigste Methode der Screening-Diagnostik ist der serologische HTLV-1/2- Antikörpernachweis, der sowohl HTLV-1- als auch HTLV-2-spezifische Antikörper erfasst. Im Gegensatz zur HIV-Infektion sind HTLV-spezifische Antikörper typischerweise erst ab dem zweiten bis dritten Monat nach Infektion detektierbar. Die spezifischen Antikörper sind als Infektionsmarker lebenslang nachweisbar.

Ein reaktiver („positiver“) HTLV-Screeningtest ist allein nicht hinreichend, um die Diagnose einer HTLV-Infektion zu stellen. Ähnlich wie bei HIV weisen die HTLV-ELISAs zwar eine hohe Sensitivität von nahezu 100% auf, d.h. die Wahrscheinlichkeit eines falsch-negativen Testergebnisses ist äußerst gering. Auch die Spezifität dieses Tests beträgt deutlich über 90%. Bedingt durch die niedrige Sero-Prävalenz von HTLV in Deutschland (<0,01%), ist der positiv-prädiktive Wert des HTLV-Screeningtests jedoch sehr gering. Mit anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit ist hoch, dass ein erstmalig positives Screening-Resultat falsch reaktiv ist, weshalb nach Einschätzung des NRZ für Retroviren ein wiederholt positives Testresultat im HTLV-ELISA durch ein zweites unabhängiges Testverfahren bestätigt werden muss.

Als Bestätigungstest sind der klassische Westernblot oder der rekombinant hergestellte Immunoblot Methoden der Wahl. Hierbei wird die Reaktivität im Serum befindlicher Antikörper gegen eine Vielzahl auf einen Nitrozellulosestreifen aufgetragener HTLV-Antigene untersucht. Eine HTLV-Infektion geht in den meisten Fällen mit einer Immunantwort gegen HTLV-Gag-Strukturproteine (p24, p19) sowie HTLV-Env-Hüllproteine (gp46, gp61/68, p21e) einher. Hierüber ist zumeist auch die Differenzierung einer Infektion durch HTLV-1 und HTLV-2 möglich. Unklare Testergebnisse erfordern „Verlaufskontrollen“, d.h. die Einsendung weiterer Patientenproben, sowie weitergehende Testverfahren zum Nachweis der viralen Nukleinsäure (siehe unten).

Bei einem ersten Nachweis einer HTLV-Infektion wird die Folgetestung einer zweiten Blutprobe des Patienten zum Ausschluss einer Probenverwechslung dringend empfohlen.

Nukleinsäure-Nachweisverfahren

Da HTLV sich fast ausschließlich zellassoziiert durch direkten Zell-Zell-Kontakt ausbreitet, liegt es in der Regel nicht als freies Virus im Probenmaterial vor. Im Unterschied zu HIV spielt der Nachweis genomischer RNA (HTLV-RNA) im zellfreien Plasma daher eine sehr untergeordnete Rolle. Aussagekräftiger ist der Nachweis der HTLV-cDNA, die in das Genom von Blutzellen integriert ist. Der quantitativen Bestimmung der HTLV-cDNA-Last in Blutzellen kommt hinsichtlich der Prognose eine große Bedeutung zu, da die Viruslast bei Patienten mit klinischer Symptomatik (z. B. adulte T-Zell Leukämie, HTLV-1-assoziierte Myelopathie, Tropische Spastische Paraparese) in der Regel deutlich erhöht ist.

Wegen der Transmission maternaler Antikörper über die Plazenta auf das Neugeborene ist die Aussagekraft der serologischen Diagnostik begrenzt, da u.U. die Herkunft der detektierten Antikörper unklar bleibt. Daher erfolgt der Nachweis einer vertikalen Infektion (Mutter-Kind-Übertragung) am sichersten durch die Detektion von HTLV-cDNA im Blut des Kindes. Das Risiko einer Übertragung auf das Kind liegt bei stillenden Müttern bei ca. 25%, wohingegen es bei ungestillten Kindern nur in ca. 5% der Fälle zu einer Übertragung kommt.

Retroviren Bulletin